На рубеже XVI – XVII веков началось наступление Московского царства на вольности донской общины. Московские власти изначально стремились обратить казаков в служилое сословие русского государства: добровольную и эпизодическую военную и сторожевую службу казаков русскому царю превратить в регулярную и обязательную.
Сильнейший внутренний кризис, разразившийся в России с конца XVI века, привел к росту податного обложения и оттоку населения на южные окраины, где беглые русские люди пополняли ряды казачества. Увеличение численности донских казаков, укрепление мощи их военно-политической организации отразилось в регулярных набегах казачьих отрядов на территорию Турции и Крыма, что вело к обострению русско-турецких и русско-крымских отношений и росту недоверия между Доном и Москвой.
В 1592 году фактический правитель страны Борис Годунов решил подчинить донских казаков, направив к ним грамоты русского царя Федора Иоанновича, в которых донцам было приказано не только вернуть в Азов турецких пленников, но и отныне «царским делом промышлять» с назначенным «головой». Вмешательство московской власти в дела донского самоуправления до крайности возмутило казаков, которые даже казнили как изменника одного из верховых атаманов – Вишату Васильева, согласившегося выполнять московские приказы. В ответ на это Борис Годунов от имени царя Федора послал на Дон грозную грамоту, в которой объявил казакам:
«и вам от нас быти в опале и казни и впредь к Москве вам к нам николи не бывать…»
Получив царский трон, Борис Годунов предпринял целый ряд карательных мер, направленных на окончательное усмирение донского казачества. По его приказу казаков не пропускали не только в Москву, но и в другие русские города, пойманных сажали в тюрьмы, а иногда и казнили. В итоге в годы Смуты многочисленные притеснения подтолкнули казаков активно включиться в политическую борьбу и оказать значительную военную поддержку «истинному» царю, а на самом деле самозванцу – Лжедмитрию I, а затем и Лжедмитрию II.
Однако после захвата польскими войсками Москвы в сентябре 1610 года, когда встал вопрос о самом существовании самостоятельного Московского царства, казаки примкнули к русским народным ополчениям и активно участвовали в борьбе за освобождение страны. Донцы сыграли значительную роль при выборе царя на Земском соборе 1613 года.
Избрав на своем Войсковом круге кандидатуру Михаила Романова, донские казаки фактически предопределили его вступление на престол. Обнищавшее в походах казачье войско хотело «немедленно получить государя, чтобы знать, кому они служат, и кто должен награждать их за службу». Став царем, Михаил Федорович Романов отблагодарил донских казаков, и уже с 1613 года возобновилась регулярная и ежегодная посылка долгожданного царского жалованья донцам.
На протяжении первых лет правления нового государя сохранялось благожелательное отношение московских властей к донским казакам. Москвой всячески поощрялся объединительный процесс донского казачества в единое Войско Донское, который явно обозначился еще с конца XVI века, но был прерван событиями смутного времени. Правительство Михаила Романова предпринимало специальные меры для повышения заинтересованности донских казаков во вхождении в Войско. В 1614 году с этой целью на Дон из Москвы было прислано царское знамя.
В 1615 году права и привилегии донского казачества были закреплены специальной царской грамотой Михаила Романова, в которой подтверждалась личная свобода (воля) донцов, их право на свободное передвижение по русским городам для свиданий с родными и торговли, а также полная самостоятельность донских казаков в делах внутреннего самоуправления, внешнеполитическая независимость Войска и его право на внешние сношения. В этот же период закрепилось незыблемое право донского казачества «не выдавать беглых с реки» (или «С Дона выдачи нет»!), в последующем так и не признанное русскими властями. К концу второго десятилетия XVII века процесс формирования единого Войска Донского, ускоренный правительственными мерами, завершился, что позволило новой неокрепшей династии Романовых в сложных условиях преодоления последствий Смуты заручиться поддержкой мощного военно-политического объединения донских казаков.
